蜘蛛丝为什么这么强？这篇《PNAS》又发现一个关键点！

蜘蛛侠靠着一束蜘蛛丝就能在摩天大楼之间飞檐走壁，不禁会问，蜘蛛丝为什么会这么强？事实上，蜘蛛丝是一种典型的天然高性能结构蛋白，其抗拉强度优于钢，同时具有高弹性，比芳纶纤维表现出更大的韧性。许多工作已经报道了使用重组蛋白和人造纤维纺丝在基因优化的生物体中生产人造蜘蛛丝，但要完全复制并与天然丝的机械性能相媲美仍然具有挑战性。其中一个主要原因是之前的重组方法只使用了MaSp1（大壶腹蛛丝蛋白(major ampullate spidroin)）、MaSp2或者两者的组合，而实际上蜘蛛丝是一种复杂的多组分材料，所含的物质远多于MaSp1和MaSp2。

为了通过定量蛋白质组学确定蜘蛛牵引丝的蛋白质成分，对于正确全面地识别与检测到的肽片段相对应的蛋白质而言，高质量的参考基因组和全长编码序列注释至关重要。日本庆应大学KazuharuArakawa教授课题组采用多组学方法定量鉴定了四种大木林蛛属蜘蛛（络新妇科（Nephilinae）亚科）的蜘蛛牵引丝蛋白成分和基因组：女郎蜘蛛、金丝蜘蛛、红腿金球织蜘蛛和大木林蜘蛛。然后，除了蜘蛛蛋白之外，作者还发现了几种共同的低分子量蛋白质。有趣的是，蜘蛛牵引丝的低分子量蛋白质成分使人造丝基材料的拉伸强度增加了一倍。这一发现将极大地推动基于蛋白质的材料的使用和研究。具体的研究结果以题为“Multicomponent nature underlies the extraordinary mechanical properties of spider dragline silk”发表在顶刊《PNAS》上。

【四种络新妇科（Nephilinae）蜘蛛的基因组草案】

因为蜘蛛基因组庞大而复杂，从头测序具有挑战性。作者从成年的母蜘蛛个体的解剖腿和头胸部组织中提取基因组DNA，并使用短读长和长读长序列技术进行杂交测序。为了获得功能基因集，作者删除了表达水平小于0.1的基因和未注释的基因，最后，分别获得了18822、45304、16899和17127个功能蛋白编码基因组，分别用于女郎蜘蛛、金丝蜘蛛、红腿金球织蜘蛛和大木林蜘蛛（如表1所示）。

【四种Nephilinae蜘蛛中的蜘蛛纲目】

作者结合目前已有的测序方法，综合比较以后，将用于基因组组装的gDNA测序读数与通过cDNA和直接RNA测序获得的几亿读数相结合，对四种Nephilinae蜘蛛的蜘蛛蛋白多样性进行编目。七个直系同源组（MaSp：大壶腹蛛丝、MiSp：小壶腹蛛丝、AcSp：腺泡状蛛丝、Flag：鞭状蛛丝、AgSp：聚合蛛丝、PySp：梨状蛛丝、和CySp：圆柱形/管状蛛丝）被称为典型的蛛丝蛋白。作者从四个Nephilinae草图基因组中获得了所有七个组，包含2到3个家族或亚家族，其中五个是全长的（MaSp、MiSp、AcSp、CySp和PySp）（详见图1）。有趣的是，蜘蛛纲目录揭示了一组不同于MaSp家族1和2的主要壶腹蛛纲，它们在Nephilinae中形成了一个独特的进化枝。作者将其命名为MaSp3B。

图 1. 四种 Nephilinae 蜘蛛中的蜘蛛素目录（蜘蛛蛋白序列特征和结构）

【蛛丝蛋白（Spidroin）和蜘蛛丝构成要素（SpiCE）的表达谱】

使用全长蜘蛛蛋白的这种高质量参考，可以立即观察到在强制卷取的女郎蜘蛛蜘蛛牵引丝中存在大量MaSp3B，作为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上高分子量部分中的一条明显带电泳（图2A）。四个物种之间显示出一致的组成（图2B）。在蜘蛛纲中，仅检测到MaSp家族成员；MaSp1、MaSp2和MaSp3占任何蜘蛛物种总量的约90%（图2B）。丝腺的转录组分析证实了MaSp3B在大壶腹丝腺中的特异性表达，类似于MaSp1/2（图2C）。这两种组学分析也清楚地证明了非蜘蛛素的一致存在，这也通过LMW部分的SDS-PAGE得到证实（图2A）。在四个Nephilinae物种中，这些基因始终表达为mRNA，其水平与大壶腹丝腺中的MaSp基因相当，而在小壶腹丝腺中的水平较低（图2C）。三种在丝（作为蛋白质）和丝腺（作为mRNA）中高度表达的蛋白质被注释为Spices，作者将它们命名为SpiCE-NMa1、2和4（SpiCE Nephilinae Major Ampullate）。其中，SpiCE-NMa2和SpiCE-NMa4为半胱氨酸含量高的CRP型。蜘蛛牵引丝中最丰富的非蜘蛛蛋白是SpiCE-NMa1，含量约为1%（图2B）。

图 2. 蛛丝和丝腺中spidroin和SpiCE的表达谱

【SpiCE使人造丝基材料的拉伸强度加倍】

作者为了研究这些蛋白质在Nephilinae蜘蛛牵引丝机械性能表达中的作用，首先制作了重组 MaSp家族蛋白质的复合膜。即使由两个或三个蜘蛛素制备复合薄膜，丝基薄膜的透明度也没有急剧下降，这表明MaSps之间的异质相互作用不会引起特定的聚集（图3A）。MaSps 的复合膜显示出相似的 β-折叠结构（图3B）。作者通过生产重组MaSp和SpiCE-NMa1的复合膜进一步测试了SpiCE包含的影响，其丰度是其他SpiCE的5倍（图2B）。使用5wt% SpiCE-NMa1与MaSp的薄膜透明度相比仅含有MaSp薄膜的透明度72.5增加到76.1，表明接近复合膜中蛋白质的相互作用（图4A）。拉伸测试表明，含有SpiCE-NMa1的MaSp薄膜的拉伸强度增加了两倍（图4）。含有2% SpiCE-NMa1的复合丝纤维显示断裂伸长率增加以及拉伸强度降低（图4C）。机械性能的这些变化表明，SpiCE-NMa1扰乱了丝分子的应变诱导结晶并使无定形区域塑化。因此，人造丝中与无定形丝相互作用的一小部分（~2%）SpiCE-NMa1可能成为修饰和调整其机械性能的分子工具。

图 3. 人造MaSp复合薄膜的物理特性

图 4. 加入SpiCE蛋白的薄膜与丝的物理特性

【总结】

作者报告了一种多组学方法，结合了高质量的基因组测序和组装、丝腺转录组学以及四种Nephilinae蜘蛛的牵引丝蛋白质组学。我们观察到该亚家族特有的MaSp3B蜘蛛蛋白以及几种非蜘蛛蛋白SpiCE蛋白的一致存在。人工合成和体外这些成分的组合表明，蜘蛛牵引丝的多组分性质，包括MaSp3B和SpicE，以及MaSp1和MaSp2，对于实现蜘蛛牵引丝的机械性能至关重要。